Dopo gli eventi di Mexico City, i ribelli Messicani continuano ad insediarsi nei territori circostanti il confine americano. Minacciano di invadere il suolo americano e di impossessarsi di un potente arsenale di armi nel Canale di Panama Hai meno di 72 ore per fermarli.
Mentre Desmond contempla l'evanescente messaggio lasciato dal Soggetto 16 nella sua cella, Lucy, macchiata di sangue, entra e gli ordina di rientrare nell'Animus. Qui il protagonista assiste alla nascita di un bambino, Ezio, nell'Italia del Rinascimento, prima di essere estromesso bruscamente. I due fuggono dall'edificio dell'Abstergo e si rifugiano in un nascondiglio segreto dove li attendono due membri della confraternita degli Assassini: lo storico Shaun Hastings e l'esperta di computer Rebecca Crane. Lucy ritiene che i Templari non siano l'unica minaccia per l'umanità, e che la chiave per svelare la verità sia un giovane nobile fiorentino.
